SZÚ

Kontaktní údaje


Státní zdravotní ústav
Šrobárova 49/48
Praha 10, 100 00
Tel.: 26708 1111
E-mail pro elektronická podání:
podatelna@szu_cz
E-mail pro elektronickou fakturaci:
fakturace@szu_cz
Běžný tvar e-mailu zaměstnanců SZÚ:
jmeno.prijmeni@szu_cz
Datová schránka: ymkj9r5
IČ: 75010330
DIČ: CZ75010330
Č. účtu: 1730101/0710
Profily zadavatele:
e-Gordion
Tendermarket
NEN
Home » Témata zdraví a bezpečnosti » Zdraví a životní prostředí » Kvalita vody » Laboratorní metodiky a vzorkování » Stanovení Clostridium perfringens
Stáhnout článek jako PDF Vytisknout

Stanovení Clostridium perfringens

Stanovení Clostridium perfringens (včetně spór) dle Vyhlášky MZ ČR č. 252/2004 Sb. a Council Directive 98/83/EC z 3.11.1998


Tento příspěvek je určen pro laboratoře hygienické služby, vyšetřující pitnou vodu v rámci monitoringu, BHD či jiného šetření. Je třeba, aby měly k dispozici v předstihu novou metodu na stanovení C. perfringens, požadavky na přístroje, zařízení, média a chemikálie a ev. mohly si i metodu předem zaběhnout v laboratoři.

Specifikace jednotlivých stanovení pro mikrobiologické ukazatele jakosti pitné vody je dána Směrnici rady 98/83/EC a bude promítnuta do Vyhlášky MZ ČR, kterou se stanoví požadavky na jakost pitné vody a limity mikrobiologických, biologických, fyzikálních a chemických ukazatelů.

Pro stanovení Clostridium perfringens (včetně spór) je určena metoda s m-CP agarem. Ta je principiálně odlišná od metody stanovení spór siřičitany redukujících anaerobů (klostridií) dle ČSN EN 26461-2. Tato metoda stanoví jen spóry, ne vegetativní buňky, protože je v metodice zařazen krok inaktivace při 75°C 15 min. a dále je použito jiné selektivní médium.

Princip stanovení:
Clostridium perfringens stanovíme technikou membránové filtrace na selektivním médiu (m-CP agar) bez inaktivace vzorku při 75°C, t.j. stanoví se vegetativní buňky i spóry. Pro potvrzení charakteristických kolonií je zařazen konfirmační test pro důkaz pozitivní kyselé fosfatázy.

Kultivační média a chemikálie:

1.selektivní médium m-CP agar:
složení:
základní médium:

tryptoza 30 g
kvasničný extrakt 20 g
sacharoza 5 g
L-cystein hydrochlorid 1 g
MgSO4.7H2O 0,1 g
bromkresolový purpur 40 mg
agar 15 g
voda (destilovaná) 1000 ml

příprava:
Rozpustíme složky základního média, upravíme pH na 7,6 a pak sterilizujeme při 121°C po dobu 15 min., necháme vychladnout a přidáme následující složky:

D - cycloserin 400 mg
Polymyxin-B-sulfát 25 mg
Indoxyl-ß-D-dlucoside 60 mg (předem rozpuštěný v 8 ml sterilní vody)
filtrací sterilizovaný 0,5% fenolftalein  
difosforečnanový roztok 20 ml
filtrací sterilizovaný 4,5% FeCl3.6H2O 2 ml

2. chemikálie pro konfirmační test:
amoniak - vodný roztok, koncentrovaný (cca 24-28 %)

Přístroje, zařízení:
zařízení pro membránovou filtraci inkubátor na 44±l°C anaerostat (zařízení na udržování anaerobní atmosféry) membránové filtry s póry 0,2 mm sklo (Petriho misky, baňky, pipety 10 ml dělené po 0,1; odměrné válce) exikátor nebo hermeticky uzavíratelný box

Postup stanovení:
Membránovou filtrací s použitím filtrů 0,2 µm filtrujeme daný objem vody, inkubaci provádíme na selektivním m-CP agaru v inkubátoru při 44±1°C po dobu 21±3 hod. za anaerobních podmínek.

Počítáme matné, neprůhledné žluté kolonie, které potvrdíme konfirmačním testem. Charakteristické kolonie (žluté) vystavíme parám amoniaku po dobu 20-30 sec. Ty, které změní barvu do růžova nebo červena jsou potvrzené kolonie.

Poznámka:
1. Konfirmační test na průkaz C. perfringens na m-CP agaru je pro mikrobiologická pracoviště poněkud netradiční. Aby se vyloučil vliv plynného amoniaku na operátory je třeba použít hermeticky uzavřený box nebo exikátor, do něhož vložíme kádinku s roztokem amoniaku a s tímto manipulujeme v digestoři nebo laminárním boxu.
2. Kompletní médium m-CP agar lze v současné době již obdržet distributory bakteriologických médií.

Kontrolní kmeny:
Kontrolní kmeny pro testování bakteriologických půd viz "Doporučené kontrolní kmeny pro testování médií" - Masarykova Univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Česká sbírka mikroorganismů (CCM), Brno, Tvrdého 14, 602 00 Brno.

m-CP agar:
pozitivní kontrola - CCM 4435 Clostridium perfrigens
negativní kontrola - CCM 1999 Bacillus subtilis

publikováno v březnu 2001 - revidováno  v květnu 2004

Nahoru