Stafylokoky – průkaz indukované rezistence ke klindamycinu (D – test)
Revize 27. 1. 2014
A. Klinické vzorky pro vyšetření citlivosti
- Citlivost k antibiotikům (včetně průkazu indukované rezistence ke klindamycinu) se vyšetřuje pouze u izolátů Staphylococcus spp. izolovaných z relevantních vzorků, odebraných v souvislosti s klinicky manifestní infekcí, případně u kmenů MRSA, izolovaných z výtěrů od nosičů.
- Nevyšetření indukované rezistence ke klindamycinu u kmenů stafylokoků může být příčinou selhání klindamycinu v léčbě /1 /.
B. Rezistence ke skupině antibiotik MLSB /1/
- Antibiotika ze skupiny MLSB, ke kterým patří 14- a 16-členné makrolidy, 15-členný azalid azitromycin, linkosamidy linkomycin a klindamycin, a streptograminy skupiny B, mají stejný nebo velmi podobný mechanizmus účinku na grampozitivní koky.
- Rezistence k antibiotikům skupiny MLSB může být způsobena různými mechanizmy. Nejčastěji je řízena geny erm (u stafylokoků jsou to geny ermA, ermB a ermC). Tyto geny determinují produkci ribozomální metylázy (erythromycin ribosomal methylase), která modifikuje cílové místo účinku všech antibiotik skupiny MLSB na ribozomu methylací 23S rRNA.
- Geny msrA, které u stafylokoků řídí eflux makrolidů a azalidů z buňky, se jako příčina rezistence uplatňují méně často. U kmenů s tímto typem rezistence je účinek klindamycinu zachován.
- Geny erm i msr jsou schopny rychle se šířit horizontálně, prostřednictvím transpozonů, nebo vertikálně, jako klony rezistentních kmenů.
- Bodové mutace, v genech kódujících ribozomální proteiny, se na chromozomu stafylokoků jako příčina rezistence vyskytují vzácně. Mohou být například příčinou samostatné rezistence kmene k linkosamidům při zachování citlivosti k ostatním antibiotikům skupiny MLSB.
C. Fenotyp rezistence k antibiotikům MLSB /1/
- Fenotypová exprese rezistence stafylokoků k antibiotikům skupiny MLSB závisí na tom, zda je rezistence způsobena metylázou syntetizovanou konstitutivně (gen ermB) nebo indukovaně (geny ermA a erm C), nebo zda je způsobena efluxem (geny msrA).
- Konstitutivní fenotyp (cMLS): je snadno rozpoznatelný, neboť inhibiční zóny (IZ) nebo minimální inhibiční koncentrace (MIC) erytromycinu a klindamycinu jsou v kategorii rezistence.
- Indukovaný fenotyp (iMLS): IZ nebo MIC erytromycinu jsou v kategorii rezistence, MIC klindamycinu (a obvykle i IZ) jsou v citlivé kategorii. K odhalení indukované rezistence ke klindamycinu lze použít například diskovou difuzní metodu s předepsaným uspořádáním disků, tzv. D-test, (viz dále).
- M fenotyp (eflux): IZ nebo MIC erytromycinu jsou v kategorii rezistence, IZ nebo MIC klindamycinu jsou v kategorii citlivosti.
- Buňka stafylokoka může obsahovat kombinaci různých genů, inaktivujících antibiotika skupiny MLSB, a fenotyp rezistence se může projevit nejednoznačně (např. růstem kolonií uvnitř IZ v rozdílné kvantitě).
D. Průkaz indukované rezistence (D – test) /2/
- Indukovanou rezistenci nelze prokázat vyšetřením MIC, neboť distribuce MIC klindamycinu u kmenů citlivých k antibiotikům skupiny MLSB a kmenů s iMLS je téměř identická..
- Klindamycin je špatný induktor ribozomální metylázy, erytromycin však produkci tohoto enzymu indukuje. K vyšetření indukované rezistence lze proto použít rutinní diskovou difuzní metodu za předpokladu, že disk s klindamycinem je umístěn v sousedství disku s erytromycinem.
- Vzdálenost mezi okraji disků erytromycinu a klindamycinu u stafylokoků musí být v rozmezí 12-20 mm. Při dodržení této podmínky lze k vyšetření použít dispenzor disků.
Tabulka 1. Podmínky pro vyšetření fenotypu rezistence stafylokoků k antibiotikům MLSB /2,3/.
| Půda | Mueller Hinton agar (MH) |
| Objem inokula | 2 – 5 ml ve fyziologickém roztoku |
| Příprava inokula | Přímá metoda roztěrem kolonií z kultury vyrostlé MH agaru přes noc |
| Koncentrace inokula | 0,5 dle McFarlandova zákalu |
| Disky | Erytromycin (obsah 15 µg), klindamycin (obsah 2 µg) |
| Uspořádání disků | Vzdálenost 12-20 mm mezi okraji disků s erytromycinem a klindamycinem |
| Inkubace | 35oC± 1oC v normální atmosféře po 18±2 h |
| Odečítání | Průměr inhibiční zóny od okrajů nevykazujících růst se měří v odraženém světle na spodní straně misky, umístěné na tmavém pozadí |
| Kontrolní kmen | S. aureus ATCC 29213* |
Kopie S. aureus ATCC 29213 v českých sbírkách kmenů: S. aureus CNCTC 5480, S. aureus CCM 4223.
E. Hodnocení výsledků
- Změří se průměr inhibiční zóny (IZ) od jejího okraje se zřetelnou inhibicí růstu.
- Průměry IZ kontrolního kmene musí být v rozmezí uvedeném v tabulce 2.
- Vyšetřovaný kmen je k antibiotikům rezistentní, vytváří-li IZ o průměru menším, než je hraniční průměr IZ pro citlivé kmeny v tabulce 2.
- Vytvoření deformované IZ ve tvaru písmene D (D zóny) kolem klindamycinu v oblasti sousedící s diskem erytromycinu svědčí o indukované rezistenci k antibiotikům MLSB.
- Vytvoření deformované IZ, uvnitř které rostou kolonie (D+ zóna), může být způsobena přítomností různých genů MLSB rezistence
- Tabulka 3 obsahuje fenotypy rezistence stafylokoků k antibiotikům skupiny MLSB , odvozené podle průměru a charakteru inhibičních zón kolem erytromycinu a klindamycinu.
Tabulka 2. Hraniční průměry inhibičních zón (IZ) pro citlivé kmeny stafylokoků a přípustné rozmezí inhibičních zón kontrolního kmene S. aureus ATCC 29213*.
| Antibiotikum | Obsah disku | Hraniční průměry IZ
pro citlivé kmeny /3/ |
Přípustné rozmezí IZ
S. aureus ATCC 29213*/4/ |
| Erythromycin (ERY) | 15 µg | ≥ 21 mm | 23 – 29 mm |
| Klindamycin (CLI) | 2 µg | ≥ 22 mm | 23 – 29 mm |
* Kopie S. aureus ATCC 29213 v českých sbírkách kmenů: S. aureus CNCTC 5480, S. aureus CCM 4223; IZ: inhibiční zóna.
Tabulka 3. Fenotyp rezistence stafylokoků k antibiotikům skupiny MLSB a hodnocení podle výsledků diskové metody.
| Fenotyp | Charakter inhibiční zóny | Obrázek |
| citlivý | kmen kolem disků s ERY a CLI vytváří IZ shodné, nebo o větším průměru než je limit pro citlivé kmeny* |  |
| cMLS (konstitutivní rezistence) | kmen kolem disků s ERY a CLI nevytváří IZ žádné, nebo o menším průměru než je limit pro citlivé kmeny* |  |
| iMLS (indukovaná rezistence) | kmen vytváří deformovanou IZ (D zónu) kolem disku s CLI v oblasti, sousedící s diskem s ERY, kolem nějž nevytváří IZ žádné, nebo o menším průměru než je limit pro citlivé kmeny* |  |
| M (eflux) | kmen kolem disku s ERY vytváří IZ menší než je limit pro citlivé kmeny v tabulce 2, IZ kolem disku s CLI není deformována a má průměr
stejný nebo větší než je limit pro citlivé kmeny* |
 |
IZ – inhibiční zóna; ERY – erytromycin, CLI – klindamycin
legenda k obrázkům: a) erytromycin (15µg), b) klindamycin (2µg)
* viz tabulka 2
Tabulka 4. Interpretace výsledků /3/.
| Fenotyp | Interpretace |
| citlivý | Kmen je citlivý k erytromycinu* i ke klindamycinu |
| cMLS (konstitutivní rezistence) | Kmen je rezistentní k erytromycinu* i klindamycinu |
| iMLS (indukovaná rezistence) | Kmen je rezistentní k erytromycinu* i klindamycinu; krátkodobé použití klindamycinu, viz sdělování výsledků |
| M (eflux) | Kmen je rezistentní k erytromycinu* a citlivý ke klindamycinu |
* a k dalším antibiotikům skupiny MLSB
F. Sdělování výsledků
- Klindamycin je alternativa oxacilinu u některých infekcí, způsobených citlivými kmeny stafylokoků, zejména u osob přecitlivělých k penicilinu.
- U infekcí kůže a měkkých tkání, způsobených komunitními kmeny MRSA (kmeny S. aureus rezistentními k oxacilinu a citlivými k většině dalších antibiotik), je klindamycin (vedle kotrimoxazolu) jednou z prioritních terapeutických alternativ.
- Interpretace testů pro sdělování výsledků je v tabulce 4.
- Při nezbytnosti lze pro krátkodobou léčbu méně závažných infekcí kůže a měkkých tkání použít klindamycin i u kmene s indukovanou rezistencí ke klindamycinu /3/.
Literatura
/1/ Roberts MC, Sutcliffe J, Courvalin P, Jensen LB, Rood J, Seppälä H. Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinants. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43:2823-2830.
/2/ European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Disk difussion methodology. Dostupné na http://www.eucast.org/
/3/ European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Dostupné na http://www.eucast.org/
/4/ European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST Routine QC tables. Dostupné na http://www.eucast.org/
NRL pro antibiotika, Centrum epidemiologie a mikrobiologie,
Státní zdravotní ústav Praha